آموزش و تجربه

دانلود پایان نامه

روش های سرولوژیک را می توان برای تشخیص وضعیت آلودگی در جنین ها نیز استفاده کرد. زیرا خون، سرم آغشته به خون موجود در پرده جنب، مایع صفاقی و محتویات شیردان دارای آنتی بادی ویژه نئوسپورا هستند. چون جنین گاوها معمولاً در 120 روزگی دارای سیستم ایمنی فعال و پاسخ دهنده هستند، ممکن است بسیاری از آن ها در برابر تاکی زوئیت های انگل که از طریق جفت به آنها منتقل می شوند، تولید آنتی بادی کنند. این آنتی بادی ها اغلب از نوع IgG1 بوده اما IgM و IgG2 نیز قابل تشخیص هستند. یافتن آنتی بادی علیه نئوسپورا کانینوم در سرم جنین های سقط شده دلیل بر آلودگی آنها است، اما نتیجه منفی نمی تواند کمکی به تشخیص کند و ارزش تشخیصی ندارد. تولید آنتی بادی در جنین بستگی به سن آبستنی، میزان در معرض قرار گرفتن با انگل و فاصله بین آلودگی جنین تا سقط دارد. آلودگی داخل رحمی جنین ممکن است باعث تحریک تولید آنتی بادی ویژه ضد نئوسپورا در تعداد زیادی از گوساله ها شود. گوساله ها باید قبل از مصرف آغوز آزمایش شوند، زیرا IgG موجود در آغوز ممکن است باعث ایجاد نتیجه مثبت کاذب شود. آنتی بادی های آغوزی ممکن است تا چندین ماه در گوساله باقی بمانند. تمامی نتایج بدست آمده از روش های سرولوژیک باید با احتیاط تفسیر شوند، زیرا سیستم ایمنی همیشه دارای یک حالت پایدار نیست و میزان آنتی بادی در حالت های گوناگون متغیر است. این حالت به ویژه در رابطه با انگل هایی که در داخل سلول میزبان پنهان شده و کیست ایجاد کرده اند و از دسترس ایمنی میزبان فرار می کنند، صدق می کند. زیرا با تضعیف شدن سیستم ایمنی میزبان، دوباره آلودگی فعال عود می کند (Dubey and Schares 2006).
یک رهیافت جایگزین برای بالا بردن حساسیت و ویژگی تشخیص ابتلا به نئوسپورا کانینوم، استفاده از روش های سرولوژیکی گوساله های تازه متولد شده برای شناسایی آلودگی در مادرانشان است. دو دلیل برای استفاده از این رهیافت وجود دارد، اولاً به علت کارآمدی بالای انتقال عمودی نئوسپورا کانینوم و ثانیاً به این علت که گوساله هایی که به صورت مادرزادی آلوده هستند قبل از مصرف آغوز، واجد مقادیر بالای آنتی بادی می باشند. این نکته اهمیت دارد که گوساله ها قبل از نمونه گیری، از آغوز گاو دیگری غیر از مادر خود استفاده نکنند
( Dubey 2003b; Williams and Trees 2000 ).
از اولین جداسازی نئوسپورا کانینوم، روش های مختلفی جهت استفاده در سگ، گاو و سایر میزبان های احتمالی، توسعه یافته است. این روش ها شامل روش فلورسنت آنتی بادی غیر مستقیم، روش آگلوتیناسیون مستقیم و روش های مختلف الایزا است
(Bjorkman and Uggla 1999).
1- 1- 13-2- روش ایمونو فلورسنت آنتی بادی غیر مستقیم (IFAT)
روش IFAT، اولین روش سرولوژیکی است که برای شناسایی آنتی بادی ضد نئوسپورا کانینوم استفاده شد. این روش توسط شرز و همکاران (1999) و بر اساس استفاده از تاکی زوئیت کامل انگل به عنوان آنتی ژن طراحی شد. برخی از محققین بر این باورند که این روش بهترین، متداول ترین و مناسب ترین روش برای تشخیص آلودگی به نئوسپورا کانینوم بوده و دارای ویژگی بسیار بالایی است. جهت انجام این آزمایشات روش های متنوعی وجود دارد که اغلب مبتنی بر استفاده تاکی زوئیت های استخراج شده از کشت سویه گاوی یا سگی نئوسپورا کانینوم است. تشخیص سرولوژی نئوسپورا در جنین های سقط شده با روش فلورسنت آنتی بادی غیر مستقیم بر روی مایعات جنینی، سرم، مایعات محوطه صدری و بطنی جنین سقط شده به ویژه در جنین هایی که در سن آبستنی بالای 6 ماه سقط شده اند، امکان پذیر است. جستجوی آنتی بادی با این روش در سرم 60 درصد از موارد آلودگی نئوسپورایی که با ایمنوهیستوشیمی تأیید شده اند امکان پذیر، ولی در جنین های زیر 4 ماه امکان پذیر نیست (Dubey et al. 1996; Schares et al. 1999).
این روش بر اساس تاکی زوئیت کامل متصل به لام که با سرم رقیق شده انکوبه می شود و در مرحله دوم با آنتی بادی های متصل به فلئورسین بر علیه ایمنوگلوبولین های گونه های حیوانات تحت آزمایش نشان دار می شود، استوار است. واکنش زیر میکروسکوپ فلئورسانس ارزیابی می شود. برای نتیجه مثبت، وجود فلئورسانس پیوسته و درخشان در اطراف ارگانیسم مورد نیاز است (Bjorkman and Uggla 1999).
جهت تشخیص آلودگی در دام های بالغ تیتر سرمی 1:640 پیشنهاد می شود، اما در گوساله هایی که آغوز مصرف نکرده اند و همچنین در جنین های سقط شده، تیتر 1:64 دارای ارزش تشخیص است. در گوساله هایی که آغوز مصرف کرده اند، تیتر سرمی 1:5120 به عنوان تیتر مثبت تلقی می شود. کارایی این روش نیازمند آموزش و تجربه است و به علت تفسیر بصری واکنش ها و نتایج، دقت IFAT به میزان دقت فرد آزمایش گر بستگی دارد. IFAT تا کنون در بسیاری از مطالعات آلودگی به نئوسپورا کانینوم در گاو استفاده شده است (Haddad et al. 2005 Bjorkman and Uggla 1999; ،).
2- 1- 13-2- روش آگلوتیناسیون مستقیم (DAT)
آزمایش NAT برای تشخیص آلودگی به این انگل استفاده شده، روش NAT بر اساس روش آگلوتیناسیون مستقیم اصلاح شده توکسوپلاسما گندئی (MAT) استوار بود. با مقایسه نتایج به دست آمده در این روش با روش IFAT مشخص شد که حساسیت و ویژگی NAT با IFAT قابل مقایسه است. همچنین مشخص شد که وقتی حیوانات با انگل های مشابه آلوده باشند، بسیار اختصاصی عمل می کند. روش NAT به علت سادگی و تطبیق پذیری آن، قابلیت استفاده برای آنالیز سرم گونه های مختلف را دارد. همچنین به راحتی قابل دسترس بوده و یکی از روش های ارزان قیمت برای ارزیابی میزان آنتی بادی ضد نئوسپورا کانینوم در حیوانات مختلف است
(Bjorkman and Uggla 1999; Packham et al. 1998; Romand et al. 1998).
اساس آزمایش NAT نیز بر پایه حضور تاکی زوئیت به عنوان آنتی ژن است، ولی تنها حضور آنتی بادی های IgG را آشکار می سازد، زیرا IgM اختصاصی و غیر اختصاصی توسط
2- مرکاپتواتانول که در این روش مورد استفاده قرار می گیرد، از بین می روند. جهت انجام این روش تاکی زوئیت های زیادی نیز لازم است. همچنین همانند روش MAT، در میکروپلیت های 96 خانه ای ته گرد انجام می شود. برای انجام این روش، ابتدا رقت های مختلفی از نمونه سرم را تهیه کرده و به تمامی چاهک های میکروپلیت، 50 میکرولیتر از بافر نمکی فسفات (PBS) حاوی 2- مرکاپتواتانل 2/0 مولار می ریزند. سوسپانسیون انگلی در آلکالین بافر را به میزان 104×2 جرم در هر میکرولیتر تنظیم می کنند. بعد از رقت سازی نمونه سرم در چاهک ها، 50 میکرولیتر از سوسپانسیون آنتی ژن نئوسپورا کانینوم را به هر کدام از چاهک ها اضافه می کنند. پلیت را به آرامی تکان داده و اجازه می دهند تا به خوبی همگن گردند، سپس به مدت یک شب در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می شوند. رسوب تکمه ای شکل روشن و فاقد تکمه در ته چاهک ها به ترتیب مربوط به واکنش های مثبت و منفی در آزمایش است. هر آزمایش دارای دو کنترل منفی و یک کنترل مثبت است. کنترل های منفی شامل آنتی ژن به تنهایی و یک نمونه سرم با میزان تیتر بالای آنتی بادی ضد توکسوپلاسما است. نمونه سرم کنترل مثبت از رت ها در طی آلودگی تجربی به نئوسپورا کانینوم به دست می آید
(Romand et al. 1998 et al. 2002; Jenkins).
3- 1- 13-2- روش الایزا
در حال حاضر هم در بررسی های تشخیصی و هم در تحقیقات، به علت حساسیت و ویژگی بالای آزمایش، سهولت کار، سریع و ارزان بودن و تعداد بالای سرم های مورد آزمایش، الایزا به عنوان روش غالب، جایگزین IFAT شده است. این روش می تواند جهت ارزیابی عفونت های مزمن نیز به کار رفته و اطلاعاتی را نیز در مورد نحوه انتقال آلودگی در گله بدهد. استفاده از تیتر سرمی مثبت بالاتر و ویژه نئوسپورا از موارد مثبت کاذب می کاهد (Dubey 2003b).
آزمایش الایزا به طور گسترده ای برای نشان دادن آنتی بادی های متصل به انواع عوامل عفونت زا مانند نئوسپورا کانینوم و توکسوپلاسما گندئی به کار می رود. در این روش سطح پلیت های چند خانه پلاستیکی با آنتی ژن های اختصاصی پوشیده می شود. پس از انکوباسیون با سرم رقیق شده مورد آزمایش، از آنتی بادی ضد ایمنوگلوبولین مختص گونه متصل به آنزیم (کنژوگه) استفاده می شود. در مرحله آخر سوبسترا اضافه می شود که در حضور کنژوگه، تغییر رنگ می دهد. پس از اتمام زمان، می توان واکنش آنزیم سوبسترا را متوقف کرد. سپس میزان جذب یا دانستیه نوری1 را توسط دستگاه قرائت کننده الایزا اندازه گرفت ((Bjorkman and Uggla 1999از روش های مختلف الایزا مانند الایزای غیر مستقیم و الایزای رقابتی نیز برای تشخیص آلودگی به این انگل استفاده می شود. این روش ها با استفاده از آنتی ژن های مختلفی مانند پروتئین های سطحی، مونوکلونال آنتی بادی و همچنین تاکی زوئیت های لیز شده با سونیکاتور جهت تشخیص آنتی بادی ضد نئوسپورا کانینوم به کار رفته است(Bjorkman et al. 1994; Bjorkman and Uggla 1999; Dubey et al. 1996; Lally et al. 1996; Pare et al. 1995a )
4-1- 13-2- تست لاتکس آگلوتیناسیون (LAT)

مطلب مشابه :  موسسات مالی و اعتباری