تولید انبوه

تولید انبوه

تولید انبوه

سیستم های پروکاریوتی و یوکاریوتی دو گروه عمده برای بیان ژن هستند. سیستم های پروکاریوتی جهت بیان ژن راحت تر هستند و تا حدی هم نتایج آن رضایت بخش است .برای مثال بسیاری از پروتئین های یوکاریوتی نیازمند تغییرات پس از ترجمه، مانند تاخوردگی ١مناسب، گلیکوزیلاسیون ٢, فسفوریلاسیون و ایجاد باندهای دی سولفیدی هستند. سیستم جامع بیان ژنی برای بیان پروتئین های نو ترکیب وجود ندارد. سیستم های بیان ژن مزایا و کاستی هایی دارند که در هنگام انتخاب آنها باید مد نظر قرار بگیرند (Rai et al. 2001).
2-1-16-2 – سیستم های باکتریایی
بدون شک در میان سیستم های بیان ژن، E.coli بیشترین کاربرد را داشته است. از این باکتری عمدتًا برای بیان پروتین هایی که نیاز به تغییرات پس از ترجمه ندارند استفاده می شود. استقبال زیاد از این میکروارگانیسم به علت اطلاعات زیاد پیرامون ژنتیک آن، شناخته شدن توالی ژنی کامل آن و وجود روش های مختلف دستکاری ژنی آن است (,Jonasson et al. 2002 Rai et al. 2001). E. coli قادر است در محیط کشت های ساده و ارزان قیمت با تراکم بالایی رشد نماید. سویه هایی از E. coli که جهت تولید انبوه پروتئین های نوترکیب بکار می روند، با دستکاری ژنتیکی به فرمی درآمده اند که ضرری را متوجه انسان نمی کنند. خالص سازی پروتئین های نو ترکیب با اتصال پروتئین های ویژه ای به آنها تسهیل می شود. ستون های کروماتوگرافی خاصی طراحی شده اند که تمایل زیادی برای جذب به این پروتئین های اتصالی دارند. از مهمترین این پروتئین ها ی اتصالی می توان به glutathione–S-transferase, His-tag, Maltose–binding fusion proteinاشاره کرد.
با وجود همه ی اینها، بیان ژن در باکتری ها با مشکلات اساسی همچون نبود تغییرات پس از ترجمه ی پروتئین ها همراه است. یکی از مشکلات عمده ی بیان پروتئین ها در باکتری ها این است که پروتئین هایی که در مقادیر زیاد بیان می شوند، در درون سیتوپلاسم سلول بر روی هم تجمع پیدا کرده و تشکیل کلوخه های غیر قابل حلی از پروتئین را می دهند که فعالیت خاصی نداشته و باید آنها را در محلول های دناتوره کننده حل کرده و در شرایط خاصی بازسرشته 3 کرد. به این کلوخه های پروتئینی درون سیتوپلاسمی(Iclusion body) می گویند (Rai et al. 2001). گاهی لیز کردن باکتری برای استخراج پروتئین های سیتوپلاسمی موجب آزاد سازی سم های درونی می شود که در نهایت باید از محصول نهایی جدا شوند. یکی دیگر از معایب سیستم E.coli ، تولید و تجمع لیپوپلی ساکارید ( LPS ) است که یک اندوتوکسین سمی برای انسان و سایر پستانداران است و باید در یک مرحله ثانوی از پروتئین های تولیدی جدا شود ( Rai et al, 2001 Terpe et al, 2006 ;).
با توجه به نکات و عوامل موثر در بیان پروتئین های نو ترکیب در E. coli اقدام به طراحی پلاسمیدها و سویه هایی از این باکتری شده که توانایی زیادی در بیان پروتئین های نوترکیب دارند. از جمله ی این سیستم های بیان ژن می توان به سیستم pET اشاره کرد.
3-1-16-2- سیستمpET
سیستمpET قویترین سیستمی است که تا به حال برای کلون کردن و بیان پروتئین های نوترکیب در باکتری E. coli ساخته شده است. ژن هدف در پلاسمید pET و تحت کنترل سیگنال های قدرتمند رونویسی و ترجمه ی باکتریوفاژ T7 کلون می شود. القا بیان ژن با فراهم آوردن منبع تولید آنزیم T7 RNA polymeraseدر باکتری میزبان انجام می شود.
T7 RNA polymerase بسیار اختصاصی و فعال است، بنابراین زمانی که به طور کامل بیان می شود، تمامی سلول در جهت بیان ژن هدف بسیج می شوند، پروتئین مورد نظر گاهی تا بیش از ۵۰ درصد پروتئین تام سلولی را چندین ساعت پس از القا بیان ژن تشکیل می دهد. با وجود اینکه این سیستم بسیار قدرتمند است، اما می توان با کاهش میزان ماده القاءگر، میزان بیان پروتئین را تا حد دلخواه پایین آورد. کاهش میزان بیان ممکن است سبب افزایش حلالیت برخی از پروتئین های هدف شود. ویژگی مهم دیگر این سیستم این است که میتوان در حالت بدون القاگر، سیستم را از لحاظ رونویسی خاموش کرد. ژن هدف ابتدا در میزبانی کلون می شود که فاقد ژن T7 RNA polymeraseاست بنابراین ناپایداری پلاسمید که در پی تولید پروتئین های مضر برای سلول پدید می آید در اینجا مشاهده نمی شود. پس از تثبیت سیستم در یک میزبان غیر بیان کننده، برای شروع بیان ژن هدف می توان یا از عفونی کردن سلول های میزبان با فاژ λCE6 که حامل ژن RNApolymerase T7 تحت کنترل λ PI ,λ PL است استفاده کرد یا اینکه پلاسمید را به میزبانی انتقال داد که به صورت کروموزمی حاوی ژن T7 RNA polymeraseتحت کنترل پروموتور LacUV5است.
در مورد دوم، القاء با افزودن IPTG یا لاکتوز به محیط کشت باکتری یا استفاده از محیط کشت خود القاء گر انجام می شود. دو نمونه پروموتورT7و چندین نمونه باکتری میزبان که توانایی متفاوتی در کنترل میزان بیان پایه دارند در دسترس هستند که ترکیب آنها، گزینه های زیادی را برای انتخاب سیستم مناسب جهت تولید یک پروتئین هدف بدست میدهد.(Novagen, pET system manual 2005)
4-1-16-2 – سیستم مخمری و قارچی
مخمر ها هم میزبان خوبی برای بیان پروتئین های خارجی هم برای تحقیقات، هم صنایع و هم استفاده دارویی هستند. چون مخمر ها میکرورگانیسم های غذایی هستند، برای تولید پروتئین های دارویی کاربرد بالایی دارند. در عوض E.coli دارای پایروژن های سمی در دیواره سلولی است. در مقایسه با سلول های پستانداران، مخمر ها خیلی سریع تر در محیط ساده رشد می کنند (در 90 دقیقه 2 برابر می شوند)، مقدار زیادی سلول تولید می کنند، ژنتیک آن ها از یوکاریوت های دیگر شناخته شده تر است، راحت قابل دستکاری است و در نهایت
پلاسمید های آن
قادر به ترشح پروتئین مورد نظر است. این یوکاریوت های ساده می توانند پروتئین مورد نظر را گلیکوزیله کنند ولی ساختار پروتئین های ساخته شده توسط مخمر ها با پستانداران متفاوت است. هم اکنون کاربرد مخمر ها بین باکتری ها و سلول های پستانداران است (Rai et al. 2001).
5-1-16-2 – حشرات
باکولوویروسها به عنوان سیستم شناخته شده ای جهت تولید پروتئین های نوترکیب در یوکاریوت ها شناخته شده اند چون یوکاریوت هستند قادرند بسیاری از تغییرات پروتئینی؛ فرآوری و انتقال پروتئین ها را که در یوکاریوت های عالی صورت می گیرد انجام دهند. باکولوویروس ها برای مهره داران عفونت زا نیستند و پروموترهایشان در سلول های پستاندران غیر فعال است، بنابراین امکان تولید پروتئین های سمی و سرطان زا در این سلول ها توسط آنها وجود ندارد . پروتئین های بیان شده عمدتٌا در جایگاه مناسب خودشان قرار می گیرند، به این معنی که پروتئین های غشایی به غشاء و پروتئین های هسته ای به هسته رفته و پروتئین های ترشحی نیز از سلول ترشح می شوند. از مهم ترین معایب سیستم باکولوویروسی این است که چون در سلو لهای بی مهرگان عمل می کنند، امکان ایجاد برخی تغییرات پس از ترجمه که مختص سلو لهای مهره داران است در آنها وجود ندارد ( Rai et al. 2001).
6-1-16-2 – سلول پستانداران
پروتئین هایی که نیاز به تغییرات پس از ترجمه در سطح پروتئین های پستانداران دارند؛ باید درون سلول های پستانداران بیان شوند. اگر درستی ساختار و کارکرد پروتئین برای ما مد نظر باشد، بدون هیچ شکی باید به سراغ استفاده از سلول های پستانداران رفت، چون بیشترین اعتبار در بین سیستم های بیان ژن از نظر نزدیک بودن پروتئین نو ترکیب با پروتئین اصلی مربوط به این سیستم است. تکنیک های بیان در پستانداران بسیار وقت گیر است و برای حجم بالای تولید مشکل آفرین است. محیط مغذی پیچیده ای برای رشد سلول ها لازم است و غلظت پروتئین تولیدی پایین است, در نتیجه فقط برای محصولات بسیار با ارزش که از نظر اقتصادی ارزش زیادی داشته باشند استفاده می شود (Rai et al. 2001).
فصل سوم

مواد و روش کار

 

مدیر

داغ ترین ها

No description. Please update your profile.

~~||~~Comments Are Closed~~||~~