تکرارپذیری

دانلود پایان نامه

یک تست آگلوتیناسیون نیز در تحقیقات نئوسپورا معرفی شده به نام روش آگلوتیناسیون مستقیم اصلاح شده (MAT) که این تست تنها روش سرولوژیکی است که به کنژوگه های آنتی بادی ثانویه یا معرف های رنگ سنج نیازی ندارد و می توان طیفی از گونه های حیوانی را با این روش آزمایش کرد اگرچه نیاز است که خصوصیات عملکردی اش برای هرگونه ارزیابی شود (Packham et al.1998).
در مطالعه حاضر، ذرات لاتکس با آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 تک یاخته نئوسپورا کانینوم پوشانده شده و سپس برای تشخیص سرولوژی آلودگی به نئوسپورا کانینوم در گاو مورد ارزیابی قرار گرفت. روش لاتکس آگلوتیناسیون در آزمایشگاه های بالینی کاربرد بسیار داشته و برای تشخیص بیش از صد بیماری عفونی به کار رفته است (Javier Gella et al. 1991). این روش اولین بار توسط سینگر و پلاتز در سال 1956 برای فاکتور روماتویید ارائه شد و به سرعت برای ارزیابی آنتی ژن ها و آنتی بادی های گوناگون کاربردی شد (Quash et al. 1978; Robbins et al. 1962). در تستهای لاتکس آگلوتیناسیون یک آنتی بادی یا آنتی ژن، سطح ذرات لاتکس را می پوشاند و زمانی که نمونه ای حاوی آنتی ژن یا آنتی بادی اختصاصی با لاتکس حساس شده شیری رنگ مخلوط می شود باعث آگلوتیناسیون قابل مشاهده می شود. ذرات لاتکس در واقع برای بهتر نشان دادن کمپلکس آنتی ژن- آنتی بادی به کار می روند. این تکنیک ها آسان هستند و مواد به کار رفته درآنها برای مدت طولانی پایدار باقی می مانند (Javier Gella et al. 1991).
در تحقیق حاضر از ذرات کربوکسیله که یکی از متداول ترین سطوح به کار رفته برای اتصال لیگاندها بوده و تا حد زیادی پایدار هستند استفاده شد. وجود گروه آمینی انتهایی روی پروتئین ها عمومیت دارد و قابلیت استفاده آنها را برای اتصال کامل به گروههای کاربردی روی سطح ذرات تضمین می کند.
LAT به صورت کیت تجاری برای تشخیص توکسوپلاسموزیس در دسترس می باشد (Kimbita et al. 2001 ). در تحقیقی که از LAT (با آنتی ژن نوترکیب TgMIC3) برای تشخیص سرولوژیکی توکسوپلاسما گندئی استفاده شده، این روش تشخیصی، تست مناسبی گزارش شده است (Jiang et al. 2008). ولی از آنجایی که TgMIC3 با NcMIC3 خیلی هومولوگ است و با سرم گاو آلوده به نئوسپورا کانینوم واکنش متقاطع می دهد
(Jiang et al. 2008) ، در تحقیق حاضر از NcSAG1 نوترکیب به عنوان آنتی ژن تشخیصی مناسب و مطمئن برای تشخیص نئوسپورورزیس در گاو استفاده شد (2005 et al. Chahan et al. 2003; Liao).
اگرچه تجزیه و تحلیل مولکولی نشان داده است که نئوسپورا کانینوم رابطه بسیار نزدیکی با تک یاخته توکسوپلاسما گندئی دارد (Marsh et al. 1995) اما طبق اطلاعات موجود تاکنون گزارشی مبنی بر استفاده از LAT برای تشخیص سرولوژیک آلودگی به نئوسپورا کانینوم منتشر نشده است.
اکثر کیت های تجاری، آنتی ژن های طبیعی که در محیط کشت یا در موشها تولید شده را برای تشخیص آنتی بادی استفاده می کنند که این آنتی ژن ها روی اختصاصیت و تکرارپذیری نتایج تست تاثیر می گذارند (Jiang et al., 2008; Kimbita et al., 2001). بنابراین استفاده از آنتی ژن نوترکیب می تواند از این معایب جلوگیری کند و تکامل روشهای تشخیصی پیشرفته را فراهم می کند (Jiang et al., 2008, Liao et al., 2005).
در حین واکنش انگل و میزبان، پروتئین های سطحی سلول های انگل، اهداف اصلی پاسخ های ایمنی میزبان هستند. بنابراین آنتی ژن های سطحی انگل ها اهداف منطقی برای استفاده به عنوان فاکتورهای تشخیصی هستند. NcSAG1 آنتی ژن سطحی نئوسپورا کانینوم شناخته شده و به عنوان یک آنتی ژن ایمنودومینانت تایید شده و به خوبی در ایزوله هایی که در مناطق مختلف جغراقیایی هستند نیز حفظ شده است
(Hemphill et al. 1997; Howe et al. 1998) بنابراین، این آنتی ژن به عامل تشخیصی مهمی برای شناسایی آنتی بادی ها علیه نئوسپورا کانینوم در نظر گرفته شده است.
با استفاده از روش PCR، 813 جفت باز از ژن NcSAG1 سویه 1 نئوسپورا کانینوم به دست آمد و در وکتور pET-28a کلون شد و در باکتری E. coli به صورت متصل به his-tag در انتهای 5′ بیان شد. سیستم بیان E. coli نسبت به سایر سیستم های بیان دارای مزایایی است، روشهای بیان و خالص سازی با این سیستم خیلی راحت تر است. اگرچه ژن خارجی بیان شده در E. coli اغلب به صورت نامحلول ظاهر می شود خصوصا وقتی سطح بیان بالا باشد (Chahan et al. 2003).
در مطالعه حاضر نیز کل آنتی ژن نوترکیب NcSAG1، به صورت نامحلول بیان شد که ممکن است به علت سطح بالای بیان باشد.
چاهان و همکاران در سال 2003 گزارش کردند که پس از برداشتن توالی های کدکننده پپتید آبگریز در انتهای کربوکسیلی و آمینی، حلالیت آنتی ژن نوترکیب NcSAG1به میزان زیادی افزایش می یابد. آنها این آنتی ژن فاقد پپتید آبگریز را آنتی ژن نوترکیب NcSAG1 کوتاه شده نامیدند (rNcSAG1t). نتایج این گزارش با مطالعه ای که توسط هو و همکارانش در سال 2002 انجام گرفت متفاوت است. در مطالعه دوم، آنتی ژنNcSAG1t بیان شده در E. coli نامحلول بود که ممکن است به علت این حقیقت باشد که NcSAG1t فقط پپتید آبگریز انتهای آمینی را نداشته است اما واجد پپتید آبگریز انتهای کربوکسیلی بوده است
( Chahan et al. 2003).
در مطالعه حاضر، آنتی ژن نامحلول نوترکیب NcSAG1 پس از جداسازی کلوخه های غیر قابل حل به وسیله سونیکه کردن و سانتریفیوژ، و پس از حل کردن آن تحت شرایط دناتوره کننده و دیالیز کردن در بافر refolding، بازتاخورده شد. پروتئین بازتاخورده به آسانی در حجم زیاد تهیه می شود، به راحتی استاندارد شده و قابلیت تکرار پذیری در یک آزمایشگاه یا بین آزمایشگاههای مختلف را دارد.
به منظور بررسی این که آیا آنتی ژن نوترکیب تولیدی می تواند آنتی ژن مناسبی برای تشخیص نئوسپورورزیس در گاو باشد، NcSAG1 نوترکیب بازتاخورده، بوسیله تست لاتکس آگلوتیناسیون (LAT) مورد ارزیابی قرار گرفت. پوشاندن مناسب ذرات لاتکس برای انجام این تست ضروری و حیاتی است. به منظور رسیدن به بهترین میزان پوشش ذرات و نیز رقت و نسبت مناسب ذرات به نمونه، مقادیر متفاوت پروتئین برای پوشش دادن ذرات لاتکس مورد ارزیابی قرار گرفت. (Maehara et al. 1990; Matsuzawa et al. 1983). در نهایت، بهترین میزان پروتئین با کمترین آگلوتیناسیون منفی کاذب انتخاب شد و برای بررسی نمونه های سرمی به کار گرفته شد.
نتایج تحقیق حاضر نشان داد که آنتی ژن نوترکیب NcSAG1بر اساس LAT ، با دو نمونه از سه نمونه سرم گاو و دو نمونه سرم انسان که به توکسوپلاسموزیس مبتلا بودند واکنش متقاطع نداد (et al.2003 (Chahan. آلودگی طبیعی با نئوسپورا کانینوم و یا حضور آنتی بادی ها علیه آنتی ژن های باکتری اشرشیا کلی می تواند دلیل ایجاد آگلوتیناسیون آن یک نمونه سرم گاو مبتلا به توکسوپلاسموزیس باشد. از آنجایی که در این مطالعه فقط سه نمونه سرم گاو آلوده به توکسوپلاسما گندئی در دسترس بود، نیاز به تحقیقات گسترده تری برای رد کردن واکنش متقاطع احتمالی می باشد.
به منظور مقایسه LAT با سایر روشهای تشخیصی موجود، نتایج LAT و الایزای تجاری بر روی 164 نمونه سرم گاو مورد ارزیابی قرار گرفته و مقایسه شدند. اگرچه در حیواناتی که به صورت طبیعی آلوده بودند، تفاوتهایی در نتایج به دست آمده مشاهده شد؛ اما بر اساس نتایج، میزان انطباق به دست آمده از هر دو تست بالا و ضریب کاپا 77/0 بود که طبق معیارهای ثبت شده، درجه تطابق بین آنها قابل توجه (substantial) تفسیر می شود . Landis و Koch در سال 1977 برای تفسیر ضریب کاپا معبارهایی را تعیین کردند به این صورت که اگر ضریب کاپا کمتر از صفر باشد درجه تطابق، ضعیف (poor) در نظر گرفته می شود، در صورتی که ضریب کاپا بین صفر و 2/0 باشد درجه تطابق، کم و ناچیز (slight) گزارش می شود، اگر ضریب کاپا بین 21/0 و 4/0 باشد، درجه تطابق نسبتا خوب یا متوسط (fair) است، اگر این ضریب بین 41/0 و 6/0 باشد، درجه تطابق، مناسب (moderate) ، اگر بین 61/0و 8/0 باشد، درجه تطابق، قابل توجه (substantial) و اگر بین 81/0و 1 باشد، درجه تطابق، عالی (almost perfect) است(Landis and Koch 1977).
تست الایزا با استفاده از آنتی ژن های tNcSRS2 -GST وGST-NcSAG1t برای تشخیص نئوسپورا کانینوم طراحی و مورد استفاده قرار گرفته است و نتایج نشان می دهد که این تست، حساسیت و اختصاصیت بالایی دارد و واکنش متقاطعی با سرم مثبت توکسوپلاسما گندئی ندارد (Liu et al. 2007 ; Pinitkiatisakul et al. 2005; et al. 1997; Hemphill Gaturaga et al. 2005; Ahn et al. 2003; ).).
اما اکثر تستهای تشخیصی به صورت کیت های تجاری وارداتی هستند و این کیتها پرهزینه و وقت گیرند و به مواد و ابزارخاصی نیاز دارند که آن ها را برای کاربرد فیلدی و کلینیکی نامناسب می سازد (2005 et al. Chahan et al. 2003; Liao). اما در تحقیق حاضر نشان داده شد که LATبا استفاده از آنتی ژن نوترکیبNcSAG1 به علت کاربرد سریع و ساده ، مدت زمان کوتاه واکنش، هزینه پایین و اختصاصیت بالا، ابزاری معتبر برای آزمایش اولیه آنتی بادی ها علیه نئوسپورا کانینوم خصوصا در آزمایشگاه های کوچک در مناطق دوردست خواهد بود (Mazumder et al. 1988; Sukthana et al. 2001; Jiang et al. 2008).

مطلب مشابه :  خصوصیات افراد خود تنظیم که عامل موفقیت اون هاست