نگهداری

دانلود پایان نامه

– نگهداری در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به حالت shaking به مدت یک شب
– انتقال سلولهای کشت داده شده به میکروتیوب و سانتریفیوژ به مدت 4 دقیقه با سرعت 8500 دور در دقیقه تا سلول های باکتریایی ته نشین شوند. محیط کشت رویی دور ریخته شد.
– افزودن ۲۵۰ میکرولیتر بافر معلق کننده به ته نشین سلولی و به خوبی سلول ها درون بافر معلق شدند
– افزودن ۲۵۰ میکرولیتر بافر لایز کننده به میکروتیوب حاوی مواد فوق . چندین مرتبه به آرامی به هم زده شد. تا شفاف شدن محلول، میکروتیوب به مدت ۵- ۱دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد.
– افزودن ۳۵۰ میکرولیتر بافر خنثی کننده به میکروتیوب. ۴- ۳ مرتبه به آرامی به هم زده شد .
– نگهداری میکروتیوب در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه
– سانتریفوژ به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه
– انتقال محلول شفاف رویی بدست آمده به ستون های جاذب و سانتریفیوژ به مدت۱۰ دقیقه با سرعت ۱۰۰۰ دور در دقیقه. برگرداندن مجدد محلول عبور کرده به ستون و سانتریفیوژ مجدد طبق شرایط قبل
– سانتریفیوژ به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه و افزودن ۵۰۰ میکرولیتر بافر غیر فعال کننده ی اندونوکلئاز به ستون و سانتریفیوژ به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه
– افزودن ۷۰۰ میکرولیتر بافر شستشو به ستون و سانتریفیوژ به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه و دور ریختن مایع عبوری
– ستون به مدت یک دقیقه ی دیگر با سرعت ۱۴۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شد تا محلول شستشو کاملا خارج شود و محلول عبوری دور ریخته شد.
– انتقال ستون به میکروتیوب استریل و افزودن 60 میکرولیتر آب مقطر استریل فاقد DNase . پس از یک دقیقه سانتریفیوژ با سرعت 14000 دور در دقیقه به مدت 3-2 دقیقه تا پلاسمید متصل به ستون آزاد شده و در ته میکروتیوب استریل جمع آوری شود. برای آگاهی از عملکرد روش فوق، مقدار ۵ میکرولیتر از پلاسمید خالص شده در ژل آگاروز یک درصد الکتروفورز و برای توالی یابی ارسال شد.
۱۱- ۳- برش قطعات حاوی NcSAG1 و پلاسمید pET-28a
عمل هضم آنزیمی بوسیله ی آنزیم های محدود کننده ی مربوط انجام شد. واکنش های صورت گرفته به شرح زیر بود:
۱-۱۱- ۳- برش NcSAG1 و پلاسمید pET-28a با آنزیم های NcoІ و ІІІ Hind
در این مرحله ابتدا قطعات مذکور طبق واکنش جدول ۳-۳ با آنزیم ІІІ Hindو سپس طبق واکنش جدول ۳-۴ با آنزیم NcoІ برش داده شدند. هر واکنش به مدت یک شب در حمام آب گرم در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شد، پس از آن در ژل آگاروز یک درصد الکتروفورز شدند و سپس طبق روش انجام شده در بند ۵- ۳ خالص سازی شدند.
جدول۳-۳: ترکیبات واکنش برش pTZ- NcSAG1 با آنزیم ІІІ Hind
مقادیر (میکرولیتر ) مواد مصرفی
۱۴ ۱۴ Buffer Hind ІІІ(10x)

مطلب مشابه :  کارکردهای خانواده، رضایت از زندگی، مکتب فرانکفورت