نگهداری

دانلود پایان نامه

– نگهداری در 37 درجه سانتیگراد به حالت Shaking تا زمانی که OD محیط در طول موج 600 نانومتر به 600/0-550/0 برسد
– برداشت 1 میلی لیتر نمونه از محیط، سانتریفیوژ در دور 8000 به مدت 2-1 دقیقه، دورریختن مایع رویی ،اضافه کردن 100 میکرولیتر بافر نمونه (ضمیمه) به رسوب و نگهداری در 20- درجه سانتیگراد برای SDS-PAGE
– تقسیم هریک از محیط های کشت (کنترل و 2852 ) در 3 ارلن استریل در حجم مساوی (30 میلی لیتر)
– القاء بیان با اضافه کردن IPTG برای رسیدن به غلظت های نهایی 1 ، 1/0 و 01/0 میلی مولار در سه ارلن جداگانه (سه غلظت برای کنترل و سه غلظت برای 2852) .
– نگهداری در 37 درجه سانتیگراد به حالت Shaking.
– 2 ساعت بعد از القاء : برداشت 1 میلی لیتر نمونه از محیط، سانتریفیوژ در دور 8000 به مدت 2-1 دقیقه، دورریختن مایع رویی ،اضافه کردن 100 میکرولیتر بافر نمونه به رسوب و نگهداری در 20- درجه سانتیگراد برای SDS-PAGE
– 4 ساعت بعد از القاء: برداشت 1 میلی لیتر از محیط، سانتریفیوژ در دور 8000 به مدت 2-1 دقیقه، دورریختن مایع رویی ،اضافه کردن 100 میکرولیتر بافر نمونه به رسوب و نگهداری در 20- سانتیگراد درجه برای SDS-PAGE
– ادامه نگهداری در 37 درجه سانتیگراد به حالت Shaking به مدت یک شب.
– برداشت 1 میلی لیتر از محیط، سانتریفیوژ در دور 8000 به مدت 2-1 دقیقه، دور ریختن مایع رویی ،اضافه کردن 100 میکرولیتر بافر نمونه به رسوب و نگهداری در 20- درجه سانتیگراد برای SDS-PAGE
– سانتریفیوژ بقیه محیط کشت، دورریختن مایع رویی، اضافه کردن 700 میکرولیتر PBS 1X و شناور کردن رسوب و نگهداری آن در 20- درجه سانتیگراد
۲۰-۳- خالص سازی (Purification) پروتئین های تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی(Inclusion body) تحت شرایط دناتوره کننده
پروتئین های تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی تحت شرایط دناتوره کننده با استفاده از کیت Ni-NTA Spin Kit ساخت شرکت QIAGEN، خالص سازی گردید.
– اضافه کردن 1 میلی لیتر بافرB (بافر لایزکننده :اوره 7 مولار) به 300 میکرولیتر از ته نشین های سلولی بدست آمده از مرحله قبل
– اضافه کردن Benzonase به میزان U3 به ازای هرمیلی لیتر از کشت
– تکان دادن لوله ها در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه تا محیط شفاف شود
– سانتریفیوژ با سرعت 12000 دور در دقیقه در دمای اتاق به مدت 30- 15 دقیقه
– اضافه کردن 600 میکرولیتر بافر B (بافر لایزکننده :اوره 7 مولار) به ستون نیکل (Ni–NTA Spin Kit) و سانتریفیوژ با سرعت 890 دور در دقیقه به مدت 2 دقیقه
– برداشت 40 میکرولیتر از lysate و اضافه کردن 60 میکرولیتر بافر نمونه و نگهداری در 20- درجه سانتیگراد جهت ارزیابی پروتئین با روش SDS-PAGE
– اضافه کردن 600 میکرولیتر از lysate به ستون نیکل (متعادل شده با بافر B) و نگهداری در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه

مطلب مشابه :  جامعه‌پذیری سیاسی، مشروعیت سیاسی، توسعه نیافتگی