نگهداری

دانلود پایان نامه

اضافه کردن 300 میکرولیتر Carbodiimide 1% (EDAC) به رسوب و نگهداری در Rotator در دمای اتاق به مدت 5/3 ساعت
سانتریفیوژ با سرعت 8600 دور در دقیقه به مدت 7 دقیقه در 25 درجه سانتیگراد ، دور ریختن مایع رویی و اضافه کردن 750 میکرولیتر بورات بافر 2/0 مولار (ضمیمه)و Vortex
تکرار مرحله قبل (2 بار دیگر)
اضافه کردن 600 میکرولیتر بورات بافر 2/0 مولار و Vortex
اضافه کردن 25 میکرولیتر (غلظت نهایی: 05/0 میلی گرم در میلی لیتر) و 30 میکرولیتر (غلظت نهایی: 06/0 میلی گرم در میلی لیتر) پروتئین نوترکیب NcSAG1 در دو میکروتیوب جداگانه برای ارزیابی تأثیر غلظتهای مختلف
نگهداری در Rotator در دمای اتاق به مدت یک شب
سانتریفیوژ مشابه قبل ، دور ریختن مایع رویی و اضافه کردن 500 میکرولیتر از محلول BSA (10mg/ml) در بورات بافر 2/0 مولار (ضمیمه) و به آرامی مخلوط کردن به مدت 30 دقیقه
تکرار مرحله قبل (2 باردیگر)
اضافه کردن 250 میکرولیتر PBS 1X ، معلق سازی محتویات و نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد
۲۶- ۳- جمع آوری نمونه های سرم:
در این بررسی 32 گله ازگاوداریهای حومه شیراز انتخاب شدند و از ده درصد جمعیت گله، نمونه خون گرفته شد که در مجموع تعداد 164 نمونه خون جمع آوری شد. خونگیری از ورید وداج با استفاده از ونوجکت و سر سوزن یک بار مصرف صورت گرفت. نمونه های خون کد گذاری و به آزمایشگاه منتقل شد. نمونه های خون جهت تشکیل لخته به مدت یک ساعت درانکوباتور 37 درجه سانتیگراد و یک ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از سانتریفیوژ با سرعت 1000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه، سرم جدا شد و سرم حاصله توسط سمپلر به داخل میکروتیوب های شماره گذاری شده انتقال داده شد. پس از اتمام کار، میکروتیوب ها به فریزر منتقل و تا زمان انجام آزمایش در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۲۷-۳- انجام تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT) ):
به منظور انجام LAT بر روی نمونه های سرم جمع آوری شده از گاوداریهای حومه شیراز، یک قطره از نمونه سرم بر روی اسلاید ریخته شد و با حجم مساوی از سوسپانسیون ذرات لاتکس پوشیده شده با آنتی ژن نوترکیب مخلوط گردید و زمان آگلوتیناسیون ثبت و نتایج تفسیر شد (همراه با هر نمونه، کنترل مثبت و منفی نیز تست شدند).
به منظور انجام LAT بر روی نمونه های سرم گونه های مختلف نمونه های سرم سگ، گاو، بز، اسب و انسان با تست لاتکس آگلوتیناسیون مورد ارزیابی قرار گرفت و نتایج تفسیر گردید.
برای تعیین اختصاصیت تست و بررسی واکنش متقاطع آنتی ژن نوترکیب NcSAG1با نمونه های سرم مثبت توکسوپلاسما گندئی از سه نمونه سرم گاو و دو نمونه سرم انسان آلوده به توکسوپلاسما گندئی استفاده شد که قبلا با تست الایزا آلودگی آنها تأیید شده است.
۲۸-۳- انجام تست الایزا
این تست با با استفاده از کیت تجاری iscom ELISA ( ( Svanova Biotech AB, Sweden و طی مراحل زیر انجام شد.
– مخلوط کردن 10 میکرولیتر از هر نمونه سرم با 990 میکرولیتر PBS-Tween رقیق شده
– ریختن 100 میکرولیتر از هر نمونه سرم رقیق شده در حفرات پلیت الایزا به صورت دوپلیکیت

مطلب مشابه :  اضطراب آشکار و پنهان، فرزندپروری مقتدرانه، دانشگاه فردوسی مشهد