اندازه گیری

دانلود پایان نامه

– بیان ژن مورد نظر در محیط کشت LB
– حل کردن (Solubilization) و بازتاخوردگی ( Refolding) پروتئین تولیدشده به فرم گنجیدگی های درون سلولی(Inclusion body)
– اندازه گیری غلظت پروتئین تولیدشده با روش لوری
– انجام تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT) ) بر روی سرمهای جمع آوری شده
– انجام تست الایزا با استفاده از کیت تجاری برروی سرم های مشابه
– ارزیابی ارزش تشخیصی تست لاتکس آگلوتیناسیون LAT) ) در مقایسه با تست الایزا
1-3- طراحی پرایمرها
توالی پرایمرها بر اساس توالی های ثبت شده از نئوسپورا کانینوم در بانک ژن (NCBI) صورت گرفت.
پرایمر ها طوری طراحی شدند که یک جایگاه برش برای آنزیم محدود کننده ی NcoI در پرایمرForward
(NeoNcoF: 5’-CTGATGCCATGGTCAATCAAGTTGTCACCTGTGAC-3)
و یک جایگاه برش برای آنزیم محدود کننده ی HindIII در پرایمر Reverse
(NeoHindR: 5’-GACTAGAAGCTTTGTTACAGCGAAAAGGGAAACGC-3’ ) به فاصله چند باز، در بالا دست توالی آن ها وجود داشته باشد. اندازه مورد انتظار برای محصول PCR 833 جفت باز بود که 810 جفت باز از آن مربوط به قطعه ای از ژن آنتی ژن سطحی NcSAG1 است.
طراحی پرایمرها با توجه به هدف تحقیق حاضر، یعنی بیان پروتئین به صورت متصل به 6 اسیدآمینه ی هیستدین (به عنوان His-tag ) و همچنین با توجه به ساختار پلاسمید بیان ژن بکار رفته، یعنی pET-28a ، صورت گرفت. پروتئین تولیدی، طولی معادل 284 اسید آمینه شامل یک اسیدآمینه متیونین در ابتدای زنجیره، 270 اسیدآمینه از آنتی ژن سطحی NcSAG1، 7 اسید آمینه اضافی مربوط به توالی وکتور بعد از محل برش آنزیم HindIII و 6 اسیدآمینه هیستیدین خواهد داشت.
2- 3- تهیه تاکی زوئیت نئوسپورا کانینوم
در این مطالعه از سویه 1 نئوسپورا کنینوم(NC1) موجود در مؤسسه رازی شیراز استفاده شد. کشت انگل طبق روش دوبی و همکاران (1988) انجام شد. به این صورت که پس از کشت رده سلولی Vero و تشکیل یک لایه سلولی در روز سوم، محیط کشت تازه RPMI-1640 (Sigma, USA) همراه با تاکی زوئیت های NC به فلاسک کشت سلولی اضافه گردید. محیط کشت حاوی 2 درصد سرم جنین گوساله، محلول های آنتی بیوتیک پنی سیلین (10,000 U/ml)و استرپتومایسین (100 µg/ml)و ضد قارچ آمفوتریسین (25 µg, In vitrogen; USA) بود که در شرایط دمایی oC37 و 5 درصد Co2 نگهداری شدند. با بررسی روزانه فلاسک های حاوی نئوسپورا با استفاده از میکروسکوپ معکوس، زمانیکه 90- 80 درصد سلول های Vero با ایجاد ضایعات سلولی توسط تاکی زوئیت های نئوسپورا تخریب شدند، تاکی زویت ها جمع آوری شدند. سپس جهت جداسازی بقایای سلول های Vero، محیط ها دو بار سانتریفیوژ (min10 ،g 2000) شده و بقایای سلولی جدا شدند. در آخر تعداد تاکی زویت ها در هر میلی لیتر محیط با استفاده از لام هموسیتومتر نئوبار شمارش شد
(Dubey et al. 1988; Dubey and Schares 2006).
3- 3- استخراج DNA از تاکی زوئیتهای نئوسپورا کانینوم خالص شده
استخراج DNA از تاکی زوئیتهای نئوسپورا کانینوم با استفاده از فنل و بافرهای کیت خالص سازی پلاسمید
plasmid extraction kit AccuPrep® ساخت شرکت BIONEER (کره جنوبی ) طی مراحل زیر انجام شد.

مطلب مشابه :  تصمیم گیری در شرایط اطمینان کامل