انعطاف پذیری

دانلود پایان نامه

تستهای لاتکس آگلوتیناسیون از سال 1956 برای تشخیص طیف گسترده ای از مواد شیمیایی در آزمایشگاههای بالینی مورد استفاده بوده اند. ذرات لاتکس از مواد آلی مختلفی با قطرهای متفاوت ساخته می شوند. مولکولهای پروتئینی و سایر مولکولها یا بصورت غیر فعال به ذرات لاتکس باند می شوند و یا به منظور تسهیل اتصال به ذرات، از طریق پیوند کووالانسی به گروههای شیمیایی فعال باند می شوند (Javier Gella et al. 1991).
تستهای لاتکس آگلوتیناسیون در آزمایشگاه های بالینی خیلی کاربردی هستند. این تستها برای تشخیص بیش از صد بیماری عفونی به کار برده می شوند. اولین بار این تست توسط سینگر و پلاتز در سال 1956 برای فاکتور روماتویید ارائه شد(Singer and Plotz 1956). از آن زمان به بعد این تستها برای تشخیص عفونتهای باکتریایی و ویروسی، بیماریهای خود ایمن، هورمونها، داروها و پروتئینهای سرم توسعه یافته و توسط شرکتهای زیادی در سراسر دنیا به بازار عرضه شده (Javier Gella et al. 1991). LAT تستی سریع و کارامد است (دو دقیقه از زمان آماده سازی نمونه) که حتی تحت ابتدایی ترین شرایط قابل انجام است و برای استفاده در فیلد ، آمبولانس یا محل خواب ایده آل هستند (1990 Carney).
در تستهای لاتکس آگلوتیناسیون یک آنتی بادی یا آنتی ژن، سطح ذرات لاتکس را می پوشاند و زمانی که نمونه ای حاوی آنتی ژن یا آنتی بادی اختصاصی با لاتکس حساس شده شیری رنگ مخلوط می شود باعث آگلوتیناسیون قابل مشاهده می شود. ذرات لاتکس برای بهتر نشان دادن کمپلکس آنتی ژن- آنتی بادی به کار می رود. اکثر تستهای لاتکس آگلوتیناسیون به صورت دستی انجام می شوند و آگلوتیناسیون به صورت چشمی قابل مشاهده است. اگرچه این تستها در آزمایشگاه قابل انجام هستند و به علت عدم نیاز به ابزار و وسایل، ارزان هستند اما این آزمایشات دستی به علت عدم ثبات در بازخوانی نهایی مشکل دارند (Javier Gella et al. 1991). در طول سالهای اخیر روشهای متعددی برای تشخیص آگلوتیناسیون ذرات لاتکس شرح داده شده از جمله این روشها اسپکتروفوتومتری و نفلومتری است که نور پخش شده یا جذب شده را اندازه می گیرند.
ذرات لاتکس معمولا به وسیله امولسیون پلیمریزه شده تهیه می شوند (Bangs 1987). استیرن با یک محلول سورفکتنت مانند SDS مخلوط می شود و به صورت بیلیونها میسل هم قطر به حالت تعلیق در می آید سپس یک آغازگر پلیمریزاسیون محلول در آب مانند پتاسیم پرسولفات اضافه می شود. وقتی پلیمریزاسیون پایان یافت، زنجیره های پلی استیرن به داخل میسلهایی با قسمت هیدروکربن در مرکز و یونهای سولفات انتهایی روی سطح ذره که با فاز آبی در تماس است مرتب می شوند (شکل 8-2). هیدروکربنها و مشتقات دیگری نیز در ساخت ذرات لاتکس استفاده می شوند (Bangs 1988).
به این دلیل ازاصطلاح لاتکس استفاده می شود که از یک رزین سنتزی به وجود می آید و امولسیون حاصل ظاهری شیری دارد. این ذرات در انداره های مختلف از 05/0 تا 2 میکرون در دسترس هستند و به علت گروههای سولفات و سولفونات دارای شارژ سطحی منفی هستند که می توان سطح این ذرات را به منظور تسهیل اتصال و نیز افزایش پایداری اتصال اصلاح کرد. این تغییرات کاربردی شامل کربوکسیله کردن، آمیدی کردن، آمینی کردن، هیدروکسیله کردن و حتی مغناطیسی کردن هستند (Bangs 1988,1987). همچنین این ذرات با رنگهای متنوع برای بازخوانی بصری در دسترس هستند.

مطلب مشابه :  رضایتمندی زناشویی

شکل 8-2: نمودار پلی استیرن ذرات لاتکس. زنجیره توپ های سیاه، نشاندهنده پلی استیرن با رادیکال های آزاد سولفات هستند (توپ های هاشور خورده). توپ های سفید رنگ، نشاندهنده گروه اسید سولفونیک هستند. دنباله آزاد نشاندهنده انتهای هیدروکربن است.
ساده ترین روش متصل کردن پروتئینها به ذرات از طریق جذب غیرفعال (Passive) است. لاتکس و پروتئینها در یک محلول بافری مناسب مخلوط می شوند و به یک موازنه می رسند و چندین بار شسته می شوند تا زمانی که ذرات از بقایای پروتئینهای باند نشده آزاد شود (Rush et al. 1975; Dezelic 1971).
مشکل اصلی جذب غیرفعال این است که پروتئینها به تدریج از ذرات جدا می شوند و ویژگیهای آگلوتیناسیون لاتکس حساس شده را چندین بار تغییر می دهند. همچنین برخی مولکولها روی ذرات لاتکس باند نمی شوند یا به جایی متصل می شوند که دور از دسترس است. این مشکلات عموما از طریق پیوند کووالانسی مولکول به سطح ذره برطرف می شود(Javier Gella et al. 1991). این احتمال وجود دارد که بتوان با پیوند کووالانسی، پروتئین بیشتری (10تا 40 درصد) روی سطح قرار داد (Douglas and Monteith 1994). از مزایای دیگر پیوند کووالانسی این است که پروتئین باند شده با این نوع پیوند، به حرارت مقاوم تر است. این مسئله در مواردی که ذرات در PCR یا سایر روشهایی که به چرخه حرارتی نیاز دارد استفاده می شوند، می تواند خیلی مهم باشد(et al. 1991 Gibbs).
روشهای گوناگونی برای اتصال کووالانسی پروتئینها و سایر مولکولها به ذرات از طریق گروههای شیمیایی روی سطح ذرات ابداع شدهاند (Masson et al. 1981). احتمالا بهترین پیوند شیمیایی شناخته شده که استفاده می شود وجودگروههای کربوکسیل (COOH) روی ذرات لاتکس( (Carboxylated-modified latex (CML) هستند که از طریق کربودای ایمید (carbodiimide) محلول در آب (WSC) در pH:6-8به گروههای آمینی روی پروتئین باند می شوند (Hager 1974). یکی از کربودای ایمید هایی که بطور شاخص استفاده می شودEDAC (3-ethyl carbodiimide hydrochloride-((3-Dimethylaminopropyl-1 ( است. مشکل اصلی این کربودای ایمید های محلول در آب این است که قدرت تفکیک ندارند و به صورت متقاطع به پروتئین متصل می شوند و این امکان وجود دارد که همه چیز را به همدیگر متصل کند و توده ای (clump) از ذرات تشکیل می شود که با پیوند کووالانسی به همدیگر متصل شده اند و در اکثر مواقع، مشکل تشکیل توده وجود دارد
(et al. 1978 ;Quash1973 ;Goodfriend 1964 ; Guilford Cuatrecasas 1970). ممکن است قرار دادن یک زنجیره کوتاه هیدروکربن به عنوان یک فاصله دهنده که پیوند انعطاف پذیری از لیگاندها به سطح ایجاد می کنند موثر باشد (Bangs 1987).
اندازه ذره پیشنهاد شده برای LAT 9/0 – 2/0 میکرون است و جنس ذره پیشنهاد شده برای آگلوتیناسیون، پلی استیرن یا پلیمرهایی است که سطحش تغییر داده شده است. مرحله پوشانندگی( (Coating، حساس است و به محاسبه دقیق یا آزمایش نیاز دارد تا به آن پوشش مناسب و مورد نظر دست یابیم. در نمای کلاسیک آگلوتیناسیون وقتی آنتی ژن به سطح ذره متصل می شود آگلوتیناسیون شروع می شود. وقتی دو جایگاه شناسایی آنتی بادی روی مولکول با آنتی ژنهایی که روی ذرات جداگانه هستند واکنش می دهند، ذرات را به همدیگر متصل می کند (شکل9-2). اگر آنتی ژنها خیلی نزدیک به همدیگر روی سطح قرار گیرند، آنتی بادی می تواند بین آنتی ژنهای مجاور روی یک ذره پل ایجاد کند به جای اینکه گروهها را روی ذرات جداگانه متصل کند (شکل9-2). اگر آنتی ژنها خیلی دور از یکدیگر روی سطح پراکنده شوند یا اینکه فاصله ذرات از یکدیگر خیلی زیاد باشد ، احتمال ایجاد آگلوتیناسیون خیلی کم می شود. اگر میزان آنتی بادی در یک نمونه خیلی زیاد باشد می تواند تمام سطح ذره را بپوشاند و مانع آگلوتیناسیون شودو نیز اگر برای هر جایگاه آنتی ژن روی ذره، یک آنتی بادی وجود داشته باشد هیچ اتصالی اتفاق نمی افتد و مانع آگلوتیناسیون می شود که به این وضعیت اثر Hook یا Prozone گفته می شود.
برای ارزیابی coating مناسب برایLAT پیشنهاد می شود که از Box titration یا checkerboard که برای آگلوتیناسیون روی اسلاید تنظیم شده استفاده شود این تکنیک برای بهینه سازی میزان پوشش ذرات، رقت مناسب یا نسبت ذرات به نمونه برای بهترین میزان حساسیت آگلوتیناسیون طراحی شده است
(Matsuzawa et al. 1983 Maehara et al. 1990;).

مطلب مشابه :  اهداف سیاست پولی

شکل 9-2: حالات مختلف نتیجه واکنش آنتی ژن- آنتی بادی در نسبت های مختلف از غلظتهای آنتی ژن- آنتی بادی
2- 13-2 – روش های تشخیص بافتی
آزمایش سرم گاوهای سقط کرده، تنها نشان دهنده مواجهه با نئوسپورا کانینوم است و برای تشخیص تفریقی نئوسپوروزیس، آزمایشات بافت شناسی از جنین مورد نیاز است. مغز، قلب، کبد، جفت و مایعات بدن یا سرم خون بهترین نمونه ها برای تشخیص هستند و در صورتی که چند نمونه آزمایش شود، قدرت تشخیص افزایش می یابد. هر چند ضایعات ناشی از نئوسپوروزیس در اندام های مختلفی یافت می شود، ولی مغز جنین همیشه درگیر است
(et al. 2001 Morales Dubey 2003b;).