مجموعه

مجموعه

مجموعه

ابتدا قالب پلاستیکی تانک باز شده و یکی از اسفنج های آغشته به ترانسفر بافر ( ضمیمه ) ؛بر روی قالب گذاشته شد و یک ورق کاغذ صافی خیس شده با ترانسفر بافر به ابعاد برابر با ابعاد ژل روی اسفنج قرار گرفته و سپس با قاشقک کوچکی حباب گیری شده و ژل مورد نظر بر روی کاغذ صافی گذاشته شد.
کاغذ نیتروسلولز خیس شده در ترانسفر بافر، بر روی ژل قرار گرفت و سمت بالای آن علامت گذاری شد و پس از حباب گیری مجدداً یک ورق کاغذ صافی و اسفنج خیس شده در ترانسفر بافر به ترتیب بر روی کاغذ نیتروسلولز گذاشته شد. درب قالب پلاستیکی بسته شده و با دو تکه کش دو طرف قالب به یکدیگر مهار شدند. پس از آماده سازی، ساندویچ بلات درون تانک دستگاه بلات حاوی ترانسفر بافر گذاشته شد به طوریکه ژل به طرف قطب منفی دستگاه باشد و جریان الکتریسیته ملکول های پروتئینی موجود در ژل را به روی کاغذ نیتروسلولز منتقل نماید.
تانک به همراه یک قطعه مگنت در داخل ظرف حاوی یخ گذاشته شده و این مجموعه بر روی دستگاه استیرر قرار گرفت. تانک به دستگاه تغذیه نیرو وصل شده و بر روی جریانی حدود 35 میلی آمپر تنظیم شد. پس از گذشت حدود 3-2 ساعت ساندویچ بلات از تانک ااکتروفورز خارج شد.
2-24-3- مسدود سازی سطح کاغذ (Blocking)
بعد از بیرون آوردن ساندویچ بلات از تانک الکتروفورز، کاغذ نیتروسلولز با کمک پنس از بین دو اسفنج بیرون آورده شده و به مدت یک شب در داخل پتری دیش حاوی محلول بلاک کننده [ محلول 3 درصد شیر خشک بدون چربی درTBS (ضمیمه)] قرار داده شد. روز بعد کاغذ نیتروسلولز از داخل شیر بیرون آورده شده و سه بار با محلول TBS(ضمیمه) به خوبی شسته شد و سپس با توجه به تعداد سرمهای مورد آزمایش، توسط قیچی و بدون تماس دست، به صورت نوار های باریکی (به صورت عمودی) بریده شد.
3-24- ۳- اضافه کردن سرم ضد نئوسپورا
رقتهای مختلف سرم خرگوش (200/1 ، 100/1 و 50/1) که به صورت تجربی با تاکی زوئیت نئوسپورا آلوده شده بود، با 10 میلی لیتر محلول 3 درصد شیر خشک بدون چربی در TBS در داخل لوله آزمایش مخلوط شد. سپس برش های کاغذ نیتروسلولز دارای پروتئین نوترکیب NcSAG1 در هر لوله قرار گرفت و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت انکوبه شد.
4-24- ۳- اضافه کردن آنتی بادی کنژوگه
لوله ها از داخل انکوباتور بیرون آورده شده و محتوای آنها خالی و نوار های کاغذ نیتروسلولز توسط پنس به دقت خارج شده و در داخل پتری دیش حاوی محلول TBS قرار گرفته و سه بار با TBS به خوبی شسته شدند. سپس 30 میکرولیتر آنتی بادی ضد IgG خرگوش (HRP- Anti – Rabbit IgG) (کنژوگه با پراکسیداز) با منشاء بز با 30 میلی لیتر محلول 3 درصد شیر خشک بدون چربی در TBS مخلوط شده و روی سطوح کاغذها ریخته شد، به طوری که سطح آنها به خوبی پوشانده شود. سپس به مدت یک ساعت نوارها در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند.
5-24- ۳- اضافه کردن محلول سوبسترا
نوارهای نیتروسلولز از محلول آنتی بادی کنژوگه خارج شده و پس از سه بار شستشو با TBS داخل محلول Developer قرار گرفتند. .محلول Developer شامل محلول رنگزای دب (DAB= Diamino benzidin) در تریس 50 میلی مولار با 4/7pH: به همرا H2O2 ( به عنوان سوبسترای آنزیم پراکسیداز ) بود. پس از ظهور رنگ در محل باندهایی که با سرم واکنش داده بودند، برای توقف واکنش، نوارها از محلول سوبسترا خارج شده و در داخل آب مقطر قرار گرفتند. برای ثبت نتایج از ژل های پلی اکریل آمید قبل و بعد از بلاتینگ و نیز از کاغذ نیتروسلولز عکس تهیه شد.
۲۵- ۳- پوشاندن (Coating) ذرات لاتکس با آنتی ژن نوترکیب NcSAG1:
ریختن 250 میکرولیتر از سوسپانسیون 5/2 % ذرات لاتکس کربوکسیله پلی استیرن (قطر۰/۸میکرون) در میکروتیوب
اضافه کردن 750 میکرولیتر کربنات بافر 1/0 مولار به سوسپانسیون (ضمیمه)
سانتریفیوژ با سرعت 7200 دور در دقیقه به مدت 7 دقیقه در 25 درجه سانتیگراد و دور ریختن مایع رویی
تکرار مرحله قبل
اضافه کردن 750 میکرولیتر PBS 1X و Vortex کردن آن
سانتریفیوژ با سرعت 7200 دور در دقیقه به مدت 7 دقیقه در 25 درجه سانتیگراد و دور ریختن مایع رویی
تکرار مرحله قبل (2 بار دیگر)

 

مدیر

داغ ترین ها

No description. Please update your profile.

~~||~~Comments Are Closed~~||~~